Ru（II）复合物的凋亡活性的试验样本评估

作者：李勇 北京市朝阳区六里屯社区卫生服务中心(北京城建老年病医院)

对Ru（II）配合物与BSA进行了电子吸收和荧光发射光谱研究与DNA结合方法相似，只是使用BSA代替CT-DNA。
抗菌和抗氧化评价采用3种革兰氏阴性（大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和铜绿假单胞菌）和3种革兰氏阳性（黄体微球菌、枯草芽孢杆菌和巨芽孢杆菌）采用良好扩散法对所有合成的化合物进行抗菌活性检测。简而言之，将大约20 mL的营养琼脂培养基倒入经过消毒过的培养皿中。细菌试验菌在营养肉汤中培养24 h。采用各细菌微生物培养50 μL的营养肉汤培养液（1×105 CFU/mL）制备细菌草坪。用消毒的不锈钢软木钻制备了直径为5毫米的琼脂孔。将所有化合物溶解在DMSO中，得到1 mg/mL的原液。每个孔装载100 μL，二甲亚砜（DMSO）为阴性对照，链霉素（DMSO中的100μg）为阳性对照。将培养皿在37°C下孵育24小时，并检查是否存在抑制区。测量抑制区直径，记录每个生物体的平均值，并以毫米为单位表示。采用肉汤稀释法测定MIC（最低抑菌浓度）。
DPPH清除%ðÞ¼Ao样本=Ao100，其中Ao是对照反应的吸光度，样本是样品的吸光度。抗坏血酸被认为是其已知的抗氧化活性的阳性对照，也被平行测试。MTT测定法标准-二甲基噻唑）二苯基四唑溴化铵测定程序采用。将细胞放置于96孔微检测培养板中（每孔8×103个细胞），在5%二氧化碳培养箱中在37°C下培养过夜。将配合物在DMSO中溶解，用RPMI 1640稀释，加入孔中，最终浓度在10−6~10−4m之间。添加培养基（100 μL）制备对照孔。用含有不含细胞的培养基的孔作为空白孔。培养皿在5%二氧化碳培养箱中以37°C孵育48小时。孵育完成后，在每孔中加入原液MTT染料溶液（20 μL，5 mg/mL）。4h后，加入含有N、N-二甲基甲酰胺（50 %）和十二烷基硫酸钠（20 %）的缓冲液（100 μL），使MTT甲瓒溶解。然后在微孔板分光光度计上在490 nm波长上测量每个孔的光密度。半抑制浓度值是通过绘制复杂浓度的存活百分比图并读取50 %细胞相对于对照存活的浓度来确定的。每个实验至少重复三次，以得到平均值。HeLa肿瘤细胞系为本研究的研究对象。
为了评估Ru（II）复合物的凋亡活性，将HeLa Cells 1×106培养，用Ru（II）复合物以半抑制浓度剂量处理24小时，4°C离心。然后用1 mL冰PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤细胞2次，洗涤2 min。微球在500 μL的HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸）结合缓冲液中重悬，并在4°C下洗涤5 min。将细胞重悬于70 μL的HEPES结合缓冲液中，加入5 μL的膜联蛋白V，室温黑暗下孵育15 min。在室温黑暗孵育后，用流式细胞仪进行分析。
细胞周期阻滞吖啶橙是一种核酸选择性异色染色剂，可用于细胞周期的测定。在PBS中调整浓度为1×106个细胞/mL时的细胞悬液。加入缓冲液I（20 mM柠檬酸-磷酸盐，1 mM EDTA，0.2蔗糖，0.1 % Triton X-100）0.5 mL，4°C，搅拌悬浮并孵育10 min。加入缓冲液II（10 mM柠檬酸磷酸，0.1 M氯化钠），AO 0.5 mL，4°C，搅拌悬浮。HeLa细胞用钌配合物处理，并用流式细胞仪进行分析。
分子对接研究分子对接用于预测两个分子之间形成的分子间复合物的结构。将小分子与大分子对接是一项复杂而困难的任务。Accelry的发现工作室软件在本研究中用于设计铅分子和估计药物和蛋白质结合复合物的对接相互作用，配体与靶标形成的键的数量。对于受体配体相互作用，本研究使用了发现工作室的LibDock模块，LibDock是一种将配体到受体活性结合位点的高通量算法，也是一种站点特征对接算法。在运行LibDock之前，将配体和蛋白质原子应用于CHARMM力场。人类DNA拓扑异构酶1受体下载自RCSB PDB（PDB ID-1T8I）的晶体结构；利用发现工作室去除蛋白质的所有水分子，稳定电荷，填充缺失的残基，生成侧链。该受体应具有生物活性和稳定状态。受体建成后，应确定受体内的活性位点。受体可能有许多活性位点，但应该选择感兴趣之一。钌配合物用工具绘制草图，并用于对接到目标结合位点。研究了具有较高的得分的结果姿态，并检测了相互作用的配体目标复合物。在虚拟筛选的过程中，利用评分函数来估计配体结合的亲和力，以筛选出活性和非活性化合物。