Oxicam型非备体抗炎药抑制NPR1介导的水杨酸途径

作者：黄勇 北京积水潭医院

非甾体抗炎药（NSAIDs），包括水杨酸（SA），靶向哺乳动物环氧化酶。在植物中，SA是一种防御激素，它调节免疫相关基因的主要转录调节因子——非致病相关基因1（NPR1）的表达。我们发现，奥昔康类非甾体抗炎药泰诺昔康（TNX）、美洛昔康和吡罗昔康，而不是其他类型的非甾体类抗炎药，对细菌免疫和SA依赖性植物免疫反应具有抑制作用。TNX治疗降低NPR1水平，独立于提议的SA受体NPR3和NPR4。相反，TNX诱导胞浆氧化还原状态的氧化，这也受到SA的影响，并调节NPR1稳态。半胱氨酸标记试验表明，NPR1中的半胱氨酸残基可以在体外氧化，导致NPR1的二硫桥低聚，但无论SA或TNX处理如何，在体内都不能。因此，本研究表明，奥昔康抑制NPR1介导的SA信号传导，而不影响NPR1的氧化还原状态。
植物保持免疫机制以限制病原体的入侵。病原体已经进化并分泌过多的效应分子，以抑制宿主免疫反应并促进定植。反过来，植物进化出同源的抗性蛋白来识别这些效应物，从而产生强烈的免疫反应，称为效应物触发免疫。这种类型的免疫通常与过敏反应有关，即局部细胞死亡，以限制病原体的生长。
水杨酸（SA）最初从白柳（Salix alba）树皮中分离出来，两千多年来一直被用于缓解疼痛和退烧。SA衍生物，如阿司匹林、乙酰水杨酸和其他结构类似物，属于一类被称为非甾体抗炎药（NSAIDs）的药物，通常用于治疗疼痛和炎症。NSAIDs的主要靶点是环氧化酶（COX）酶，在人类炎症过程中将花生四烯酸转化为前列腺素。在植物中，SA作为一种关键的植物激素发挥作用，对生物营养和半生物营养的病原体进行免疫所需。许多植物在病原体感染时产生和积累较高水平的SA。SA降解酶的异位表达或SA缺乏导致植物对感染的易感性，而SA的外源应用增强了植物的防御反应。拟南芥非致病相关基因表达子1（NPR1）是一种转录辅因子，调节SA依赖性信号通路，95%以上对SA类似物苯并噻二唑有反应的基因是NPR1依赖性。最近，NPR1也被证明是Cullin 3 E3泛素连接酶的接头。
最近的研究表明，NPR1及其同系物NPR3和NPR4对SA具有亲和力，并参与SA感知。由于SA促进了NPR1–NPR3相互作用，但破坏了NPR1-NPR4相互作用，因此建议NPR3和NPR4作为Cullin 3 E3泛素连接酶的衔接子，以响应SA15而转换NPR1。对NPR4–SA复合物的结构分析表明，SA完全埋在NPR4的疏水核中，从而导致其剧烈的构象变化，这可能会破坏NPR1–NPR4的相互作用。形成NPR4与SA相互作用表面的氨基酸残基在NPR1同系物中高度保守，证实了NPR1也与SA19结合。相比之下，Ding等人证明NPR3和NPR4是SA应答基因的转录共阻遏物，但在SA结合时，这种阻遏物会丢失。此外，同一研究报告，SA与NPR1的结合促进其转录激活。
拟南芥NPR1是一种富含半胱氨酸的蛋白质，其活性受到半胱氨酸残基20的翻译后修饰的调节。特别是，Mou等报道，在正常条件下，NPR1主要作为低聚物存在于细胞质中，该低聚物通过半胱氨酸残基之间的氧化还原敏感分子间二硫键形成。后来，Tada等人发现NO供体S-亚硝基谷胱甘肽促进Cys156的S-亚硝基化，进而促进二硫桥NPR1低聚。SA积累导致细胞氧化还原平衡向还原状态转移，然后通过硫氧还蛋白介导的二硫键还原释放活性NPR1单体，因此，NPR1被认为是植物中的氧化还原传感器。
此前，我们利用拟南芥悬浮细胞Pseudomonas syringae pv建立了高通量筛选方法。番茄DC3000（Pto）avrRpm1系统用于鉴定植物免疫启动剂。在该系统中，悬浮细胞表现出由效应蛋白AvrRpm1的识别触发的免疫相关程序性细胞死亡。植物免疫启动化合物，如SA和噻替尼，在10 µM浓度28。通过筛选一组化学文库，我们分离了几种植物免疫启动化合物，这些化合物在本试验中增强了效应器触发的细胞死亡。
在这里，我们报道了一类非甾体抗炎药——奥克西敏（oxicams），它增强了效应器引发的细胞死亡，但与SA不同，它抑制了对细菌的免疫，并下调了植物中SA依赖性免疫反应。其中，替诺昔康（TNX）干扰SA诱导的细胞氧化还原转移，这对NPR1稳态非常重要，并广泛抑制SA应答基因，降低NPR1水平，而不依赖于NPR3和NPR4。值得注意的是，我们的生化证据表明，无论SA或TNX处理如何，体内NPR1的主要形式都是还原型，这不支持先前提出的NPR1的低聚物-单体过渡模型。
在先前使用Pto-avrRpm1诱导的拟南芥悬浮细胞培养物中的细胞死亡26的筛选试验中，我们鉴定了19种NSAID化合物作为细胞死亡增强剂。8种NSAID化合物来自MicroSource库，13种化合物来自NPDepo库30，包括布洛芬（IBF）和酮洛芬（KPF），这两种化合物都包含在两个库中（补充图1和补充表1）。我们从化学结构方面选择了八种具有代表性的化合物进行进一步研究。与阿司匹林类似，通过应用丙酸衍生物（IBF和萘普生（NPX））、乙酸衍生物（吲哚美辛（IDM）和舒林酸（SLD））、邻氨基苯甲酸衍生物（甲芬那酸（MFA））和奥昔康衍生物（TNX、美洛昔康（MLX）和吡罗昔康（PRX）），尽管在模拟处理的对照中，一些在较高浓度下是有毒的。