培养神经元的神经突长度的实验

作者：王鋆泉 北京市朝阳区六里屯社区卫生服务中心(北京城建老年病医院)

使用倒置DMI6000B显微镜（徕卡微系统）以5秒间隔记录2 min的延时视频，配备63X/1.4-0.6 NA平面-后彩色油浸物镜，EMCCD数码相机，并由变形软件控制。为了实际上消除两个通道采集之间的延迟，照明依次由488nm和561nm二极管声光关闭激光器和一个针对488/561nm激光源优化的双带滤光片立方体。实验采集期间的环境温度平均为37°C。斐济软件被用于漂白校正和电影蒙太奇。利用冰成像软件
STED成像：使用凝集素小麦胚芽凝集素（WGA）与Alexa 488 nm结合，在37°C下培养10 min，在活神经元上标记神经元膜。神经元用4% PFA /0,2%戊二醛混合物洗涤和固定，然后进行免疫化学处理。生长锥用3D STED显微镜成像，使用775 nm脉冲耗尽激光和电动领93X甘油物镜。对内源性E-Syt2的一抗进行清除，用二抗偶联Alexa 594标记。Sec22b-pHL用一抗GFP和ATTO647N二抗标记。采集在三维STED中进行，使体素大小是各向同性的。通常，我们在20到25 z平面上成像一个1400x1400像素的矩阵，以包括所有的生长锥体积。生长锥使用Icy“HK意思”插件.进行分割E-Syt2-和Sec22的空间分布分析是使用“冰SODA”插件和一个专用的LD协议自动化完成的。简单地说，通过Ripley函数分析了E-Syt2和Sec22b的分布。在同心目标上评估了两个分子之间的统计耦合。在4个不同的生长锥中分析了超过13784个E-Syt2簇，
20%与Sec22b有统计学相关性。当相关联时，这两个分子在84nm ±9nm，这与细胞科学杂志接受的34%的Secc22b簇对应。这种耦合具有非常高的意义，因为p值在10-5-10-24之间。使用Icy ROI包含分析插件测量到质膜(d)的距离。PLA信号：对包括整个细胞在内的共聚焦z-堆栈进行最大强度投影，以观察PLA斑点的最大数量。使用斐济/ImageJ中的细胞计数器插件计算每个细胞的斑点数。在神经元中，分别计数细胞体和神经突中的PLA斑点，并将PLA信号除以相应隔室的面积。
神经元长度。为了分析培养神经元的神经突长度，我们使用斐济/ImageJ中的NeuronJ插件对eGFP通道z堆栈的最大强度投影进行图像分析。测量每个神经元的主要过程和分支。我们无法检测到单个细胞之间的任何关联，因此我们认为每个细胞都是一个采样单位。
尖峰面积：在Myc-E-Syt2过表达的HeLa细胞中，尖峰面积是在eGFP通道的z堆栈的最大强度投影上测量的。测量是通过从整个cel的ROI中减去没有峰值的细胞的兴趣区域（ROI），通过应用斐济/ImageJ上的工具过滤器/中位数获得
GFP-Trap下拉和免疫印迹转染的HeLa或PC12细胞在TBS（20mM Tris-HCl，pH7.5,150mM氯化钠）中裂解，包含2mM EDTA，1% Triton-X100和蛋白酶抑制剂（罗氏诊断）。以16000xg15 min离心获得澄清裂解液，1 mg蛋白在头对头搅拌下在4°C下GFP-Trap下拉1小时。使用实验室制备的琼脂糖偶联GFP结合蛋白的10μl，用裂解缓冲液洗涤四次后，珠粒在95°C下加热5 min，在Laemmli样品缓冲液中还原。可溶性材料使用10 %丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE处理，并在硝化纤维素膜上电转移（GE-hearcth）。用2.5%（w/v）脱脂牛奶、0.1%（w/v）Tween-20PBS封闭细胞膜。，感兴趣的膜区域与一抗孵育，。洗涤后，用HRP偶联的二抗印迹细胞膜。通过使用ChemiDoc发光成象仪（BioRad）进行了揭示。
从E18胚胎中提取大鼠皮质的共免疫沉淀在0-2°C在20毫米Tris：盐酸pH 7.4,150毫米氯化钠，4毫米EDTA，2毫米氯化镁和蛋白酶抑制剂（罗氏诊断），然后加入2%（w/v，最终浓度）TritonX-100后裂解30 min。在14000xg离心12 min后，在透明裂解液中检测min蛋白。通常，250毫克的组织在11mg/ml下产生1.3毫升的提取物。5毫克总蛋白（0.6 ml）与5µg蛋白g结合兔抗合成蛋白-3抗体（克隆TG0）或5µg幼稚兔Igg（最终体积0.65 ml）孵育，在4°C下在0.8ml密封的单酚柱中孵育1小时。去除未绑定的材料后用0.5 ml冷20mM Tris：盐酸pH 7.4,150mM氯化钠，4mM EDTA，0.75%（w/v）Triton X-100洗涤4次。结合材料用95°C的还原Laemmli样品缓冲液洗脱。整个洗脱液装载在10%丙烯酰胺莱姆利凝胶上。透明的裂解液（50µg蛋白，6µl在20µl还原性Laemmli样品缓冲液中）平行运行。免疫印迹后，样品在适当时切割后与抗体孵育，在室温下1小时为单抗HPC-1抗合成蛋白，或在4°C下过夜为生物素化兔抗Esyt2抗体。Sec22b的检测是在用于合成蛋白检测的膜片的低pH剥离后进行的，以消除过量的兔免疫球蛋白轻链，并与兔抗Sec22b抗体孵育（4°C过夜）。通过增强化学发光和Esyt2与Alexa680偶联链霉亲和素结合，揭示了Syntaxin和Sec22b的免疫反应性。