鲎试剂法体外研究人血浆内毒素中和的影响因素

作者：任磊 国家电网公司北京电力医院

由血浆成分引起的内毒素中和使检测人体血液中的内毒素变得困难。在这项研究中，我们使用基于鲎阿米巴细胞裂解物（LAL）的试验研究了哪些因素影响内毒素的回收。更详细检查的个体因素是脂蛋白含量、血液抗凝类型、动力学和血清二价阳离子水平。此外，还研究了LAL活性与单核细胞活化之间是否存在直接关系。我们可以证明，聚阴离子肝素增加了血液中的内毒素回收，而柠檬酸抗凝促进了内毒素中和。此外，我们可以证明，随着时间的推移，人血浆和血清中的内毒素活性显著降低。时间依赖性内毒素中和在培养4–6小时后达到最大值。通过过滤试验，我们可以确定血浆中的内毒素与脂蛋白结合，但不影响其活性。比较测量表明，血浆中内毒素的高LAL活性同时具有全血中高单核细胞激活财产。为了最大限度地回收人体血液中的内毒素，生理钙和镁浓度是足够的。本研究表明，中和内毒素的血浆成分的分子量与β2-微球蛋白（11.7kDa）相似。为了准确鉴定内毒素中和血浆成分，其导致免疫刺激内毒素活性的调节，未来必须进行进一步的研究。
内毒素是革兰氏阴性菌外细胞壁的主要成分，具有高度毒性。低至每小时1纳克/千克体重的静脉注射剂量会导致人体炎症反应1。内毒素是脂多糖（LPS），由亲水性多糖和亲脂性脂质结构域（脂质a部分）组成。LPS是炎症反应的强烈刺激剂，在极低浓度下起作用，并参与败血症、脓毒性休克和内毒素血症的发病机制2。当抗生素或补体系统杀死细菌3时，LPS从生长细菌的细胞壁释放。进入循环系统的LPS启动单核细胞和巨噬细胞的炎症反应，导致产生促炎细胞因子，如TNF-α和IL-1β4，并激活产生适应性免疫反应所需的共刺激分子5。然而，在严重的情况下，炎症失控，最终可能导致败血症或器官衰竭（图1）。
LPS刺激先天免疫。血液中的LPS激活单核细胞，从而导致炎症介质的分泌。在全身炎症中，这可能导致多器官衰竭和败血症。
如果有一种灵敏可靠的检测血液中LPS的方法，就有可能很早开始针对革兰氏阴性病原体的靶向抗生素治疗。鲎试剂（LAL）试验是最成熟的LPS定量方法。LAL试验测量了鲎（鲎）血细胞（阿米巴细胞）产生的溶血物的凝固情况，该溶血物是由内毒素引起的。脂多糖激活因子C和B后，凝血酶激活凝血，然后通过浊度法或颜色反应6评估凝血。LAL试验成功地用于检测各种工业、制药和研究样本中的LPS，包括供水、肠外液体、静脉给药药物和某些生物液体（如脑脊液）。与LAL试验在工业制药环境中的广泛应用相反，LAL试验用于检测血液中LPS的应用因抑制剂的存在而受到严重阻碍7。为了克服这些抑制，已经描述了LAL试验前的几种血浆处理方法。在这些方法中，最广泛的经验是稀释加加热8。通过稀释样品，LAL抑制物质的干扰较小，而加热变性了影响LAL测量的plamatic丝氨酸蛋白酶8,9。LPS通常由称为脂质a的疏水结构域、不重复的“核心”寡糖和远端多糖（O-抗原）组成。作为一种两亲分子，已知LPS在亲水环境中形成高分子量超过106Da的聚集体。这些聚集体的大小取决于参数，如温度、pH、亲水性和单或二价阳离子的存在10。LPS通过将酰基链整合到聚集体内部而插入聚集体中，多糖部分完全暴露于水室10（图2）。文献中有争议地回答了单体LPS分子或大的内毒素聚集体是否负责免疫系统的激活的问题。Takayama等人11，12发现，LPS单体在LAL级联和pro-B细胞系激活中均表现出显著更高的活性。许多其他研究表明，LPS聚集体负责LPS级联的激活以及免疫系统的激活13，14，15。LPS聚集体的几何形状强烈依赖于聚集体分子的化学结构。对聚集结构对生物活性的作用的研究表明，立方体LPS聚集结构具有较高的内毒素活性，而层状聚集结构具有很少或没有内毒素活性16。这种依赖性已被证明适用于多种内毒素和非内毒素结构17。尽管这一事实已经知道很多年了，但关于人血浆和血液中LPS聚集结构和聚集大小的信息很少18。
LPS聚集体的结构。在水溶液中，单核LPS分子形成胶束或囊泡形式的聚集体。二价阳离子在脂质A部分中带负电的磷酸基团之间形成桥。通过添加螯合剂（EDTA、柠檬酸盐）和洗涤剂（DOC、吐温等），LPS聚集体可以不稳定并分解成单体。与LPS聚集体相比，LPS单体在LAL级联和免疫（单核细胞活化）中不再具有活性14，15。