循环肿瘤细胞的分析研究

作者：陈会 北京市朝阳区六里屯社区卫生服务中心(北京城建老年病医院)

大多数能够检测特定突变的方法都是基于实时PCR；其他技术已经发展起来，如SNAPShot PCR和突变富集PCR与直接测序相比，这些技术更快速和敏感，但它们只能检测已知而不是罕见的突变，而且比的筛选方法更昂贵。挑战这些分子测试的最重要的问题之一是生物材料的来源。肿瘤组织总是被认为是基因分型的金标准；然而，在大多数情况下，这种材料是不可用的，因为在大多数患者中，诊断发生在肿瘤已经转移和手术切除肿瘤不被指示。有其他来源的材料，如活检或细胞学标本，但通过这些程序获得的肿瘤细胞的数量是有很大的变化的。因此，除了样本保存和肿瘤异质性外，提取的数量和质量受到组织获取的极大影响，进而干扰突变分析，产生假阳性或假阴性结果，由于所使用的技术的灵敏度限制。此外，这些程序增加了患者护理的成本，不满足患者的依从性，也不允许正确地描述区分大多数晚期疾病的肿瘤异质性。
在液体活检中检测EGFR突变由于上述限制在大量患者中面临，使用DNA的替代来源，如血液、血清和血浆样本，、对EGF受体酪氨酸激酶抑制剂的获得性耐药性的主要机制。、T790M突变影响了ATP与EGFR的结合袋，导致空间位阻，降低了EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）与受体TKI结构域结合的能力。EGFR基因第19外显子L747S和D761Y的突变和第21外显子T854A的突变也与对EGFR-TKIs的获得性抗性有关。、MET与HER3形成异源二聚体，诱导PI3K/AKT通路的EGFR独立激活。对EGFR-TKIs的其他抗性机制有： 、EGFR和HER2的扩增，AXL和/或、其配体GAS6的表达增加。进一步的旁路系统包括、 PIK3CA、(F) BRAF突变和、 MAPK1扩增，它们会导致异常的信号通路激活。、此外，在耐药肿瘤中也观察到SCLC或EMT证据的表型改变。
EGFR：EGF受体；EMT：表皮向中膜转化；SCLC：小细胞肺癌。
循环游离肿瘤（cft）DNA或循环肿瘤细胞（CTCs），正在成为一种新的肿瘤基因分型策略。对分离的循环肿瘤细胞的分析已经被深入研究，但cftDNA更容易获得和易于处理、
循环肿瘤DNA确实可以提供肿瘤异质性的快照，并应该提供通过肿瘤组织分析获得的相同信息，允许那些没有的病例的分子特征肿瘤取样是可用的。此外，就耐药机制通常在治疗后发展而言，液体活检提供了监测治疗期间突变的演变和可能的进展机会
CftDNA被肿瘤细胞释放到血液中，其机制尚未完全阐明。cftDNA很可能是肿瘤坏死、凋亡、循环肿瘤细胞溶解或活性释放的结果，它通常是高度碎片化的（<300 bp）。对EGF受体酪氨酸激酶抑制剂的获得性耐药性的主要机制。T790M突变影响了ATP与EGFR的结合袋，导致空间位阻，降低了EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）与受体TKI结构域结合的能力。EGFR基因第19外显子L747S和D761Y的突变和第21外显子T854A的突变也与对EGFR-TKIs的获得性抗性有关。MET与HER3形成异源二聚体，诱导PI3K/AKT通路的EGFR独立激活。抗EGFR-TKIs的其他机制有：EGFR和HER2的扩增，AXL和/或其配体GAS6的表达增加。进一步的旁路系统包括PIK3CA、BRAF突变和MAPK1扩增，它们会导致异常的信号通路激活。此外，在耐药肿瘤中也观察到SCLC或EMT证据的表型改变。EGFR：EGF受体；EMT：表皮向中膜转化；SCLC：小细胞肺癌。 HER3 HER2或EGFR扩增AXL GAS6 PI3K AKT mTOR RAF MEK MAPK MM增加细胞增殖和存活重要的是，来自癌症患者的cftDNA中突变等位基因的频率可能存在显著差异，一些样本显示突变等位基因的频率低于1%。非肿瘤性cfDNA可能来源于不同的过程，包括肿瘤细胞周围的正常组织的坏死或采血后的白细胞的裂解。因此，广泛应用于常规诊断的标准测序方法，如Sanger测序和焦磷酸测序，并不能显示出在非肿瘤DNA背景下检测突变所需的敏感性。事实上，cftDNA 的检测需要高灵敏度的技术。
在更大的患者队列中探索的两种技术是肽核酸（PNA）钳夹方法和治疗屏试剂盒。2009年，西班牙的一项大型研究评估了164份cftDNA样本，这些样本来自EGFR突变阳性的nsclc患者的EGFR突变，，如之前在肿瘤标本上所确定的那样。为了进行这些分析，我们使用PNA钳夹方法来识别最常见的EGFR突变，即第19外显子缺失和第21外显子中的L858R突变。该方法的敏感性为59.1%，虽然本研究中没有关于该方法特异性的报道，但最近，同样的技术被用于分析厄洛替尼与化疗的EGFR突变NSCLC患者的患者血清样本中的EGFR突变在本研究中，PNA钳夹技术的敏感性为53.2%。