肝素与无细胞DNA形成聚合物，在流动的血液中剪切伸长

作者：任磊 国家电网公司北京电力医院

肝素是一种广泛使用的抗凝剂，通过增强抗凝血酶来抑制因子Xa和凝血酶。我们最近发现，由于分子相似性，SYTOX核酸染色剂与血小板聚磷酸盐反应，其中一些与肝素相同。我们试图通过活细胞荧光显微镜研究流动血液中的肝素，使用SYTOX进行肝素可视化。用针对各种肝素结合蛋白的单克隆抗体进行免疫染色。此外，我们还研究了凝血测定中肝素活性的调节，以及其对再钙化全血流动下纤维蛋白形成的影响。我们发现SYTOX阳性聚合物出现在流动的肝素化血液中。这些聚合物通常与血小板聚集物结合，其长度（可逆地）随着剪切速率而增加。免疫染色显示，在评估的肝素结合蛋白中，它们只含有组蛋白。在凝血试验和纤维蛋白形成的流动研究中，我们发现外源性组蛋白的加入可以逆转肝素的抗凝作用。此外，在DNase I、肝素酶I/III或肝素解毒剂鱼精蛋白的存在下，聚合物不会出现。这些发现表明，肝素通过目前尚未确定的机制与全血中的无细胞DNA形成聚合物复合物。
肝素是一种高度硫酸化的阴离子多糖，含量为±15 kDa因其抗凝财产而闻名。它通过增强抗凝血酶（AT）发挥作用，而抗凝血酶反过来抑制因子Xa和凝血酶1,2。此外，肝素可以结合其他几种蛋白质，这主要是由于其高负电荷密度。除其他外，已经报道了与P-和L-选择素的特异性结合3,4。组蛋白是另一类感兴趣的结合伴侣。这种相互作用抑制组蛋白的细胞毒性和促炎作用，以及肝素5,6,7,8,9,10的抗凝血作用。此外，临床上应用的肝素解毒剂鱼精蛋白是一种组蛋白样DNA结合蛋白，它在精子发生过程中取代组蛋白，使DNA凝结11。此外，鱼精蛋白与组蛋白有进化联系，因为它来源于连接组蛋白H112，13，14。
肝素还可以与多种血小板结合蛋白和血浆衍生蛋白相互作用，如纤维连接蛋白15和血小板反应蛋白116。血小板因子4（PF4）17和肝素之间的相互作用因其参与肝素诱导的血小板减少症（HIT）18而闻名，这是肝素治疗的一种相对罕见但严重的副作用。有趣的是，最近有研究表明，纤连蛋白通过破坏肝素-PF4复合物15来保护HIT。对于其他肝素蛋白相互作用，对肝素功能的影响并不清楚。
我们最近发现，SYTOX是一种用于检测细胞外DNA的常用染色试剂，也与血小板多磷酸盐19结合。这种相互作用可能是基于多磷酸盐和DNA之间的分子相似性，例如组成（DNA具有糖磷酸盐主链）和净负电荷。由于肝素是一种高度阴离子的多糖，我们也基于与DNA的分子相似性，考虑了SYTOX也与肝素结合的可能性。我们在肝素化的人全血中进行了血小板聚集的活细胞成像，并尝试使用SYTOX对肝素进行可视化，以实验解决这一假设。在这些实验中，我们进行了一系列引人注目的观察。
聚合物在肝素化全血中流动，可通过SYTOX进行可视化当柠檬化全血补充肝素（未分级肝素；UFH或低分子肝素；LMWH）并灌注固定胶原时，观察到SYTOX阳性聚合物（图1a）。这些聚合物在相应的DIC图像中是不可见的。此外，在不存在肝素或存在五糖（磺达肝素；图S1中的定量）的情况下，它们不可见，这导致我们假设肝素被结合到这些聚合物中。在两阶段实验中，我们发现SYTOX本身不参与聚合过程（例如通过阳离子-阴离子相互作用）。首先，我们允许血小板聚集在肝素化全血中形成（即不含SYTOX）。随后，我们将SYTOX灌注在缓冲液中（现在没有肝素）覆盖玻片，显示SYTOX阳性聚合物（图S2）。通常，这些聚合物似乎粘附在血小板聚集物表面。血小板聚集物（通过血小板特异性标志物糖蛋白Ib-α；GPIb-α）的三维成像显示，聚合物位于血小板聚集物的顶部（图2）。在聚合物桥接多个聚集体的情况下，它们似乎与胶原表面无关。在形成的聚合物的数量方面存在主体间的差异；有些数字很高（例如图1b；左侧面板）。此外，聚合物长度（在实验中）也有变化，有些聚合物非常大（大于225 µm；示例图1b右侧面板）。
合物在肝素化的全血中流动，可以用SYTOX进行可视化。（a） 在UFH或LMWH（10IU/mL）存在下观察到SYTOX阳性聚合物，但在两者均不存在或五糖（penta）存在下均未观察到。（b） 聚合物数量（左图）和长度（右图）的实验变化。所有条件下的实验至少进行了三次。比例尺表示10 面板（a）和20中的µm 面板（b）中的µm。