细胞培养的实验数据

作者：翟夷 北京市朝阳区六里屯社区卫生服务中心(北京城建老年病医院)

细胞培养、siRNA和转染HeLa细胞在含有谷氨酸酶的DMEM中培养，并添加10%（v/v）牛胎牛血清。1%（v/v）青霉素/链霉素在37°C和5%二氧化碳。根据制造商的说明，使用脂质体2000转染试剂进行转染。为了敲除，根据制造商的说明，使用寡聚质体转染试剂转染对照或E-Syts siRNA寡核苷酸的HeLa细胞。针对三种人类E-Syts和对照siRNAs的双链siRNAs如前所述。常规地，转染后的细胞在分析前在盖子上培养24或48小时。
PC12细胞在37°C和5%二氧化碳的含RPMI和10%（v/v）马血清、5%（v/v）牛胎牛血清和1%（v/v）青霉素/链霉素中生长。细胞被涂在1µg/ml胶原蛋白溶液的塑料培养皿上。然后，用hNGF-α在50 ng/ml下分化细胞3-4天。PC12转染采用Amaxa核融合试剂盒V，按照制造商的说明进行。
所有涉及大鼠的实验都按照欧洲议会和2010年9月22日理事会关于保护用于科学目的的动物的2010/63/EU指令进行。如前所述制备了胚胎大鼠，并进行了修饰。细胞生长在25000-28000细胞的18毫米（1 mg/ml）或30毫米塑料皿（0.1 mg/ml）上，密度为25000细胞/2m2，培养基之前由融合的胶质喂养层调节[神经基础培养基含有2% B27补充剂和500 μM L-谷氨酰胺。神经元在电镀前使用Amaxa大鼠细胞科学杂志接受的手稿神经元核切割试剂盒按照制造商的说明进行转染。体外实验3天后，对神经元进行免疫荧光处理或裂解后进行免疫印迹分析。
肉毒杆菌神经毒素（BoNTs）治疗BoNT/A和BoNT/C是来自Thomas Binz博士、BoNT/D的一份好心的礼物。用4µM原液制备培养基中工作浓度为1 nM的毒素。过表达Myc-E-Syt2的海马神经元分别用BoNT/A、BoNT/C、BoNT/D或3DIV的初始培养基处理，并在37°C和5%二氧化碳下维持4小时。用培养基广泛洗涤后，细胞被处理进行免疫荧光或裂解进行免疫印迹分析。
将3DIV时的免疫荧光HeLa细胞和海马神经元在4%多聚甲醛PBS中固定在覆盖物上15分钟，然后在50 mM氯化铵PBS中淬灭20 min。然后在0.1%（w/v）TritonX-100PBS中渗透细胞5 min，然后在0.25%（w/v）鱼明胶PBS中封闭细胞30 min。一抗用0.125%鱼胶PBS稀释，4°C孵育过夜。洗涤后，用Alexa 488、568、594或647的二抗conjµgated在室温下孵育45 min，然后安装在延长培养基中。
海马神经元放置在冷冻金属板上。将神经基础培养基改为含有一抗的20 mM Hepes的冰DMEM。细胞在冰上培养5-10 min。然后用4°C的PBS洗涤细胞，并在室温下用4%多聚甲醛蔗糖固定15 min。固定后，细胞接受已经描述的全细胞染色方案。用抗山羊GFP抗体检测标记蛋白的总量。细胞科学杂志接受的手稿，在荧光显微镜下获得，在所有条件下进行相同的曝光。在质膜上的存在以总信号和表面信号的比率表示。
原位接近连接试验原位接近连接试验定量HeLa细胞和Aldrich，使用双链原位检测试剂橙色试剂盒进行覆盖神经元的蛋白质附近，细胞被固定，如上所述渗透，在加湿室的双链阻塞溶液（试剂盒提供）在37°C下封闭30 min。随后与兔抗Stx3（4µg/ml）或兔抗e-Syt2（2µg/ml）或兔抗钙联蛋白（2µg/ml）和小鼠单克隆抗Sec22b（2µg/ml）孵育。对于协议的其余部分，都遵循了制造商的说明。简单地说，细胞洗缓冲区3次15分钟，孵化与解放军探针原位解放军探针加和原位解放军探针抗兔，1小时在37°C潮湿的房间紧随其后的是两个洗5 min缓冲区。结扎反应在37°C下进行，在潮湿的房间中进行30 min，然后在缓冲液中洗涤两次5 min。 然后将细胞与扩增-聚合酶溶液在37°C的暗加湿室中孵育100 min。用试剂盒缓冲液。洗涤两次10分钟，然后用0.01x缓冲液B洗涤1分钟后，使用含有DAPI的双链路原位安装介质安装细胞
显微镜和图像分析共聚焦成像：在徕卡TCS SP8共聚焦显微镜中获得神经元和HeLa细胞的z堆叠共聚焦图像，使用63x/1.4油浸物镜。
HeLa细胞活体成像： HeLa共同表达mCherry-Sec22b和GFP-E-Syt2转移到成像室（室EC）和维护在克雷布斯林格缓冲（140毫米氯化钠，2.8毫米氯化钾，1毫米氯化镁，2毫米氯化钙，20毫米HEPES，11.1毫米葡萄糖）。