双抗菌反选择试验的培养数据

作者：李艳凤 北京市朝阳区六里屯社区卫生服务中心(北京城建老年病医院)

在适当的情况下，在生长培养基中添加10 mg/L红霉素或10 mg/L氯霉素。网站特异性整合载体pIMC和pSV2用于生成氯霉素和红霉素单核增生杆菌衍生品EGDe-catEGDe-ermC，而载体pUC57-lctP-catA2-aspC和pUC57-lctP-ermC-aspC构建氯霉素和红霉素抗脑膜炎奈瑟菌衍生物ATCC13090-catA2和ATCC13090-ermC。载体pAULa-Δhly和pAULa-ΔrecA是使用pAULa温度敏感载体生成的，遵循之前描述的协议.不久，用引物hly-A扩增hly-D，recA-recA800-1000bp扩增上下游区域。经PstI酶切连接后，将hly和recA的上游和下游区域扩增为单个片段，克隆到pAULa的BamHI-SalI位点，生成pAULa-Δhly和pAULa-ΔrecA。这些载体随后转化为单核增生乳杆菌，并通过单次交叉重组整合到基因组中，生成单核增生乳杆菌菌株EGDe：：pAULa-Δhly和EGDe：：pAULa-ΔrecA。同样，载体pUC57-ΔdnaK和pUC57-ΔdnaJ使用载体pUC57-ermC构建。用引物dnaK-A扩增到dnaK-D，dnaJ-A扩增到dnaJ-D和dnaJ的上下游区域，得到500-1000bp的PCR产物。上下游产物用BamHI酶切，然后连接扩增。将这些上下游融合片段克隆到pUC57-ermC的SacIHindIII位点，生成载体pUC57-ΔdnaK和pUC57-ΔdnaJ。这些载体随后转化为脑膜炎奈瑟菌，并通过单次交叉重组整合到基因组中，得到脑膜炎奈瑟菌菌株ATCC13090：：pUC57-ΔdnaK和ATCC13090：：pUC57-ΔdnaJ。通过PCR特异性载体整合和位点特异性对照引物测序确定位点特异性载体整合。单核增生乳杆菌菌株EGDe：：pAULa-Δhly和EGDe：：pAULa-ΔrecA和脑膜炎球菌菌株ATCC13090：：pUC57-ΔdnaK和ATCC13090：：pUC57-ΔdnaJ随后被用于双抗菌反选择试验，以生成无标记的帧内缺失突变体。

用单一杀菌或抑菌抗生素过夜培养的脑膜炎球菌和单核细胞乳杆菌菌株悬浮在10 mL BHI肉汤中，浓度为大约2×108 CFU/毫升，和杀菌抗生素卡那霉素（生工生物技术）、链霉素（生工生物技术）或庆大霉素（生工生物技术）的最终浓度为0,50、100，或250 mg/L，或抑菌抗生素红霉素或氯霉素的最终浓度为0、10、20或50 mg/L。悬浮液在37°C孵育，每30 min取一次，杀菌抗生素高达180 min，抑菌抗生素，脑膜炎奈瑟菌90 min，单核增生乳杆菌60 min。样品被连续稀释，并镀在BHI琼脂（单核增生乳杆菌）或BHI琼脂上，或含有5%马血清和1 mg/L可溶性淀粉的BHI琼脂上（脑膜炎奈瑟菌）。培养皿孵育24-48小时，并列举菌落。用杀菌和抑菌抗生素组合的脑膜炎奈瑟菌和单核增生乳杆菌菌株进行生存试验，培养过夜，并悬浮在10 mL的BHI肉汤中，浓度约为2×108 CFU/mL。加入浓度为0、10、20或50 mg/L的抑菌抗生素红霉素或氯霉素，悬液在37°C下孵育30 min。随后，杀菌加入抗生素链霉素（250 mg/L）或庆大霉素（单核增生乳杆菌50 mg/L 50 mg/L或脑膜炎球菌250 mg/L），悬液再孵育单核增生乳杆菌60 min或脑膜炎球菌90 min。样品被连续稀释，并在BHI琼脂（单核增生乳杆菌）或含有5%马血清和1 mg/L可溶性淀粉（脑膜炎奈瑟菌）的BHI琼脂上镀上。培养皿孵育24-48小时，并计数菌落。

脑膜炎无标记缺失突变菌ATCC 13090：：pUC57-ΔdnaK和ATCC13090：：pUC57-ΔdnaJ和L.单核细胞原体突变株EGDe：：pAULa-Δhly和EGDe：：pAULa-ΔrecA培养过夜，悬浮在10 mL BHI肉汤中，浓度约为2×108 CFU/mL。加入浓度为10 mg/L的红霉素，细菌悬液在37°C下孵育30 min。随后，加入庆大霉素50 mg/L浓度单核增生乳杆菌或250 mg/L浓度的脑膜炎杆菌，悬浮液培养单核增生乳杆菌60 min或90 min。样品被连续稀释，并在BHI琼脂（单核增生乳杆菌）或含有5%马血清和1 mg/L可溶性淀粉（脑膜炎乳杆菌）的BHI琼脂上镀上培养皿孵育24-48h，将单个菌落复制镀于含或不含红霉素的琼脂上。对红霉素敏感的菌落是进一步通过PCR和测序进行研究，利用位点特异性对照引物，确定目的基因的存在或缺失。

结果反选择法的理想杀菌抗生素应专门杀灭积极复制的细菌。氨基糖苷类抗生素是一种快速杀菌的抗生素，对快速生长的细菌最有效。它们与核糖体亚基相互作用，从而导致异常蛋白质的错误翻译和积累。因此，一种抑制翻译的抑菌抗生素应该能够防止氨基糖苷类药物的这种杀菌作用。选择三种氨基糖苷类卡那霉素、链霉素和庆大霉素进行该试验，并在时间杀伤试验中测试其杀菌活性对抗单核增生乳杆菌和脑膜炎奈瑟菌。三种氨基糖苷类药物对单核增生乳杆菌均具有较强的杀菌活性，其中庆大霉素的杀菌活性最强。即使在50 mg/L庆大霉素的最低浓度下，暴露60 min后也未检测到活菌。