miR-99b-5p调控的MFG-E8通过NF-KB途径靶向软骨细胞衰老…

miR-99b-5p调控的MFG-E8通过NF-KB途径靶向软骨细胞衰老和巨噬细胞缓解骨关节炎
作者：朱瑶 北京积水潭医院

骨关节炎（OA）是一种慢性和高度流行的关节疾病，导致老年人疼痛和残疾，给临床和经济带来巨大负担。它从软骨的破坏性变化开始，发展到关节间隙狭窄、滑膜炎症、软骨下骨硬化和骨赘形成，表现为关节疼痛、畸形和功能障碍。《世界报告》称，截至2019年，超过2.5亿人患有OA，这会降低患者的工作效率并提高退休年龄，从而导致巨大的医疗保健和社会成本。正如预测的那样，到2040年，OA可能是导致残疾的最常见的肌肉骨骼疾病形式。
为了阐明OA发病的具体机制，人们进行了大量的研究。人们普遍认为，细胞外基质（ECM）稳态失衡会引发OA软骨破坏。完整的ECM对关节软骨的正常承重功能至关重要。此外，ECM调节大多数细胞行为，是主要发育过程所必需的。然而，在OA中，许多基质降解酶，包括基质金属蛋白酶（MMPs），以及具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶（ADAMTS）显著上调，甚至在软骨破坏发生之前，这就加速了ECM的重塑和灵活性的丧失。更糟糕的是，ECM的损伤不可避免地导致软骨细胞的异常行为，从而进一步加剧OA的进展。另一个与ECM降解和软骨细胞异常密切相关的因素是细胞衰老。衰老软骨细胞的再生能力受到抑制，原始表型丢失。此外，衰老软骨细胞表现出衰老相关分泌表型（SASP），其特征是促进炎症因子的分泌，如白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α），增加ECM降解酶的生成，以及累积的氧化应激，加剧软骨损伤并促进OA的发展。
研究也非常重视滑膜炎在OA中的作用。滑膜炎症已被证明是OA发病的前体。它触发血管翳形成和破骨细胞生成，增强滑膜组织与软骨的粘附，并导致炎症介质的释放，使软骨降解过程永久化。滑膜炎的主要形态学特征是滑膜内膜中极化巨噬细胞的聚集。在骨性关节炎的发展过程中，滑膜巨噬细胞被激活、积累并极化为不同的亚型，通常可分为M1和M2极化巨噬细胞。M1巨噬细胞产生过量的促炎介质，包括IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α和环氧合酶-2（COX-2）。相反，M2巨噬细胞，也称为伤口愈合巨噬细胞，具有抗炎功能，有助于组织修复和重塑。使用M1或M2极化巨噬细胞增强的小鼠模型，我们先前证明滑膜巨噬细胞M1极化加速实验性胶原酶诱导的OA进展，而M2极化显著减轻OA发展。然而，对OA发病机制的全面理解尚待实现。
乳脂球表皮生长因子（EGF）因子8（MFG-E8），也称为乳钙粘附素，是一种分泌性糖蛋白，广泛表达于全身。最著名的是其协调凋亡细胞吞噬的重要作用，称为吞噬作用，有助于清除濒临死亡的细胞，防止潜在毒性或免疫原性细胞内物质的释放。MFG-E8的另一个突出功能是其抗炎作用，这在神经退行性疾病、糖尿病和败血症中得到了充分验证。最近，发现了更多与MFG-E7相关的表型。试验表明，MFG-E8可以将巨噬细胞重新编程为抗炎M2表型，减轻细胞凋亡，逆转细胞氧化应激，调节成骨细胞和破骨细胞之间的平衡。此外，据报道，在OA患者的滑液和血浆中，MFG-E8显著下调。然而，MFG-E8在OA中的作用尚不清楚。
在本研究中，在OA条件下检测到MFG-E8的显著抑制。因此，我们假设MFG-E8可能在OA发展中起重要作用。为了验证这一假设，我们说明了MFG-E8在原代小鼠软骨细胞、RAW264.7细胞系和手术诱导的OA小鼠中的保护作用。MFG-E8的下调加剧了OA，而补充服用MFG-E6具有治疗效果。此外，我们发现MFG-E8调节了NF-κB的激活，而上调OA中miR-99b-5p显著抑制了MFG-E6的表达。OA模型中建立了miR-99b-5p/MFG-E8/NF-κB调制轴。
为了探讨MFG-E8是否在OA发展中起作用，我们首先检测了MFG-E6在人类OA软骨中的表达。免疫组织化学（IHC）染色结果显示，与胫骨外侧平台软骨样本相比，接受全膝关节置换术的OA患者胫骨内侧平台受损软骨中的MFG-E8减少，而胫骨外侧高原软骨仅轻微受损。然后，我们利用内侧半月板手术（DMM）诱导的OA小鼠模型失稳，分析了OA进展过程中MFG-E8的表达。类似地，在正常软骨中观察到许多表达MFG-E8的软骨细胞，而在OA小鼠中，MFG-E6显示出逐渐下调的状态，同时软骨损伤增加。有趣的是，酶联免疫吸附试验（ELISA）显示DMM手术诱导OA小鼠血清中MFG-E8水平显著降低。此外，对IL-1β处理的原代小鼠软骨细胞的体外研究证实，在OA期间MFG-E8的表达降低（图S1A-C）。除软骨细胞外，我们还注意到随着DMM小鼠OA恶化，滑膜细胞，尤其是巨噬细胞样滑膜细胞中MFG-E8的表达降低。此外，western blot显示，MFG-E8在体外随着M1巨噬细胞极化的增加而急剧下调。总之，这些结果表明，随着OA的进展，MFG-E8的表达在局部和全身均下调，表明MFG-E7在OA发病机制中可能发挥作用。