血液样本的HPLC临床研究分析

作者：孟媛 北京市朝阳区六里屯社区卫生服务中心(北京城建老年病医院)

如果患者怀孕或有活动性消化性溃疡疾病或活动性炎症性胃肠道疾病，丙氨酸或天冬氨酸转氨酶水平高于正常肌酐水平上限的两倍，则患者也被排除在外。5 mg/dl或肌酐清除率50毫升/分钟，银屑病史或卟啉症，已知改变视野测量或只有功能眼睛，白内障干扰视网膜检查，血小板计数100,000/mm3，白细胞计数3,500/mm3，活跃酗酒在前2年，重大恶性肿瘤，疾病残疾分为ACR功能IV类，疾病持续时间5年，其他伴随或近期研究药物使用，以前或目前使用关节内或肌肉内类固醇，以前或目前使用肌肉内金盐，体重45 kg，或既往对萘普生治疗无效。虽然在第1阶段或第2阶段不允许进行关节内类固醇或其他注射，但在第3阶段则允许单次注射1个关节。

  研究设计和治疗方案。共有18名研究人员纳入了该方案中的患者。该研究在之前完全描述过，是一项多中心、双盲、平行、随机试验，评估每日400、800或1200mg HCQ治疗RA 。简单地说，在给药HCQ之前，之前的非甾体抗炎药被冲洗掉，疾病被允许短暂爆发，然后开始使用1000 mg/day萘普生。在达到稳定后，随后进行了一项双盲、6周的临床和药代动力学试验，比较每日剂量为400 mg、800 mg和1200mg HCQ。此后，每天服用400毫克HCQ对所有患者进行系统随访，并系统随访至24周。临床评估。定期计算标准化的、有效的疾病活动估计数（14次），包括压痛关节计数（测量66个关节）、肿胀关节计数（64个关节评估）、晨刚度持续时间、医生和患者使用10厘米视觉模拟评分（VAS）对整体疾病活动进行全球评估，以及使用10厘米VAS对患者就诊时的疼痛评估。实验室检测的疗效包括红细胞沉降率（ESR）和c反应蛋白水平，这些数据也定期获得。

安全研究。如临床研究中所述，研究人员定期进行眼科检查、Amsler网格评估和实验室检查，并解决了与不良事件相关的问题。在基线时进行胸片、心电图、G6P脱氢酶和卟啉症筛查。在筛查、基线和适当时进行了妊娠试验。材料。HCQ、DHCQ、DCQ、BDCQ和氯喹均由赛诺菲-温斯洛普公司捐赠。水、甲醇、乙醇和乙醚均为高效液相色谱（HPLC）级。所有与HCQ及其代谢物接触的玻璃器皿都使用AquaSil进行硅烷化。

采集和储存血液样本。血液样本（10毫升）在含有125单位肝素的硅烷化真空容器中收集，并保存在20°C。在接受HCQ治疗开始后的1-6、8、10、16、20和24周的常规就诊中采集血样（给药HCQ剂量后1-2小时内）。在基线、6周和24周的随访中，在24小时内收集了多个样本。

血液样本的HPLC分析。我们测量了血液中HCQ及其代谢物的浓度，而不是血浆中。由于药物在细胞中广泛积累，以及从血浆中重复分离血细胞和血小板的技术困难，全血检测允许更大的检测敏感性。加入蒸馏水（1.0 ml）、内标蒸馏水（200）、200g氯喹和150l10N氢氧化钠（1.0 ml）。用3.0 ml乙醚摇动碱化的血液，2000g离心10分钟。水相被冻结，乙醚层被转移到蒸发管中。重复醚提取，组合提取物蒸发至干燥。残渣在500流动相中重组，然后用Gelman0.45聚偏氟乙烯注射器过滤器过滤，并放置在盖聚丙烯自动样品瓶中，等待分析。

根据Tett等人的方法，采用HPLC分析血液提取物中的HCQ、DHCQ、BDCQ和DCQ，使用Waters 510等晶HPLC泵、热分离产物AS-1000自动进样器、Waters 470荧光检测器和Gilson FC204馏分收集器。HPLC检测的内标为氯喹。荧光监测的激发波长为337 nm，发射波长为405 nm。使用PENelson计算机数据处理系统记录色谱图并进行分析。构建了两条标准曲线，包括低（50-500 ng/ml)和高（100-2000 ng/ml)的药物浓度范围。最初，样品使用高范围标准进行分析。浓度为500 ng/ml的样品采用低范围标准曲线进行重新分析。分析物在聚苯乙烯二乙烯基苯固定相柱（1504.1 mm，粒径为5m）上分离。流动相由70%甲醇、30%水和三乙胺(2%体积/体积）组成。用6N盐酸将pH调整至pH 9。流动相在氦压下的封闭系统中循环利用，以防止三乙胺的蒸发。HCQ、DHCQ、BDCQ、DCQ的检测限为1.0 ng/ml，除BDCQ限为10 ng/ml外，定量限为5 ng/ml。所有化合物的日间变异系数和日内变异系数均不超过8.4%和4.0%。